独家原创|KRAS及其抑制剂的研究进展

教授，药物化学专业博士生导师，江苏省教学名师，中国药科大学副校长。现担任全国药学专业学位研究生教育指导委员会副主任委员，国家基金委生命科学部通讯评议专家，教育部本科教学审核评估专家；江苏省学位委员会委员；江苏化学化工学会理事、有机化学专业委员会委员等学术职务。《药学进展》执行主编，《中国药科大学学报》编委。主要研究方向：新药分子设计与合成研究、计算机辅助药物设计、有机合成化学、药物生物统计与计算药学。主持完成多项国家、省部级课题，目前课题组在研国家自然科学基金10项，自主知识产权的抗急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）临床候选化合物，完成以FN-1501为代表的原创性科技成果转化。获得美国FDA“突破性药物”（breakthrough）资格进入加速审批通道、临床试验许可和孤儿药资格认证。目前，FN-1501作为治疗AML的药物已被美国FDA、澳大利亚和中国NMPA批准进入Ⅰ期临床研究,有望弥补国内AML治疗的药物空白，为合理用药和临床试验方案设计提供新的选择，推动医药行业的创新发展，产生明显的社会和经济效应。迄今已培养博士研究生16名，硕士研究生90名，共发表SCI论文100余篇，获得国内外授权专利9项，其中2个代表性药物的研发历程和工艺研究发表在J Me.Chem、Angew Chem-Int Edit、Org Lett等药物研究知名期刊,为小分子创新药物的研发提供重要的科技支撑。

博士，教授，药物化学专业、药学信息学专业博士生导师。江苏省“青蓝工程”优秀青年骨干教师（2008），江苏省“青蓝工程”中青年学术带头人（2014）。美国密歇根大学（University of Michigan，AnnArbor）医学院综合癌症中心访问学者。主持和参与了国家自然科学基金，国家重大科技专项“重大新药创制”等多项科研项目。申请国内专利14项，国际专利1项，授权3项；主编或参编学术著作和教材3本；在J Med Chem、Eur J Med Chem、J Chem Inf Model J等国际学术期刊发表SCI论文80多篇。2015年研究团队发现的1.1类抗肿瘤新药临床前候选化合物以1.5亿人民币转让给上海复星医药，目前在美国、澳大利亚及中国大陆进行Ⅰ期临床。

[摘要]RAS是人类癌症中最常发生突变的致癌基因，而KRAS则是RAS家族中最常发生突变的亚型，其中多数为12位密码子的突变。突变之后的KRAS使细胞的生长、增殖不受控制，进而导致癌症的发生与发展。尽管经过了30多年的努力，但直接靶向KRAS活性位点的药物开发均以失败告终。由于KRAS与GTP的亲和力极强，同时细胞中GTP浓度较高，以至于使KRAS成为“不可成药”靶点。近期，针对突变的KRASG12C特异性共价抑制剂在临床试验中取得了突破性进展，为KRAS抑制剂的可成药性提供了临床证据。综述KRAS的结构功能及其小分子抑制剂的设计和临床研究概况，着重介绍具有代表意义的KRASG12C抑制剂和其作为抗肿瘤药物的最新研发进展，为以KRAS为靶点的药物开发提供研究思路。

KRAS蛋白（kirsten rat sarcoma viral oncogenehomolog）是RAS蛋白（rat sarcoma viral oncogenehomolog）家族中的重要一员，该家族的其他2个成员分别是HRAS蛋白（harvery rat sarcoma viral oncogenehomolog）和NRAS蛋白（neuroblastoma rat sarcoma viral oncogenehomolog），KRAS蛋白是由KRAS基因编码的一种小GTP水解酶（smallGTPase），是细胞生存和生长的重要调节蛋白。近期各大制药企业纷纷披露了KRAS抑制剂优异的临床试验结果，使得以KRAS为靶点的药物开发进入爆发期，吸引了广大研究者的注意。本文综述KRAS的结构功能及其小分子抑制剂的研究进展，以期为抗肿瘤药物的开发提供参考。

1KRAS蛋白概述

KRAS蛋白具有激活和失活2种状态（见图1），当KRAS与鸟苷三磷酸（GTP）结合时呈激活状态，而与鸟苷二磷酸（GDP）结合时呈失活状态。KRAS在激活和失活状态之间的转换受鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）和GTP酶激活蛋白（GAP）调节。GEF催化KRAS与GTP结合，使KRAS处于激活状态；而GAP使与KRAS结合的GTP水解成为GDP，进而使KRAS锁定在失活状态。

KRAS在大多情况下处于失活状态，但其可以被上游的信号因子如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）激活，激活后的KRAS可进一步激活下游的多条信号通路，如控制细胞生成的PI3K（phosphatidylinositol3-kinase，胞内磷脂酰肌醇激酶）-AKT（protein kinase B，蛋白激酶B）-mTOR（mammalian target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白）信号通路，控制细胞增殖的RAS（rat sarcoma viral oncogenehomolog，大鼠肉瘤病毒同源癌基因）-RAF（rapidly accelerated fbrosarcoma，快速加速的纤维肉瘤）-MEK（mitogen-activated protein kinase，分裂原活化蛋白激酶）-ERK（extracellular regulated protein kinases，细胞外调节蛋白激酶）信号通路，以及控制细胞因子释放的Ral-GEF（ras related protein-guanine nucleotide exchange factor，ras相关蛋白鸟苷酸交换因子）信号通路（见图2），这些信号通路在细胞生长、增殖和细胞因子释放等方面具有重要作用。

KRAS是RAS家族中最常发生突变的亚型，KRAS突变大概占RAS家族突变总数的85%，HRAS和NRAS仅发生少量突变，多为个位数占比。KRAS在多种癌症中均有突变（见表1），其中胰腺癌突变率高达90%，结肠癌和肺癌（大多为非小细胞肺癌）分别约占30%~50%和19%，胆管癌约占26%，小肠癌、皮肤癌、膀胱癌和乳腺癌等癌症中也会发生突变。KRAS基因中最常发生突变的位点是第12、13和61位的密码子，其中以12位密码子的突变最为常见。突变后的KRAS会影响其与GAP蛋白的结合能力，从而抑制GAP诱导的GTP水解。随着GTP酶水解能力下降，GTP逐渐积累，KRAS更易与GTP结合，进而使KRAS大多处于激活状态。最终导致其下游的多条信号通路被激活，诱发恶性肿瘤的发生与发展。

2KRASG12C抑制剂的设计策略以及临床研究进展

KRAS与GTP（磷酸化的GDP）结合时，KRAS活性构象蛋白表面的SwitchⅠ和SwitchⅡ处于闭合状态。当KRAS与GDP结合时，不仅失去活性而且蛋白表面出现一些结合空腔（见图3）。理论上，设计小分子靶向占据GTP结合位点，就可以使KRAS稳定在失活构象。但是由于KRAS蛋白表面非常光滑，且仅有一个与GTP结合的位点，再加之其与GTP的亲和力非常强，细胞中GTP浓度非常高，使得直接靶向GTP结合位点的抑制剂极难发挥作用。尽管研究人员尝试研发了多种竞争性GTP小分子抑制剂，但均未取得成效。

近年来，对KRAS突变体的共价抑制剂的研究取得了较大进展。KRASG12C是一种常见的KRAS突变，当12位甘氨酸突变为半胱氨酸后，有可能可以与小分子共价结合，因此研发与此半胱氨酸结合的变构位点（allosteric）抑制剂具有较好的开发前景。加州大注：P表示磷酸化，S为硫原子学的Ostrem等首次报道了具有一定活性的KRASG12C小分子抑制剂，验证了研发共价小分子抑制剂的可行性，从此开启了KRASG12C共价小分子抑制剂研发的新篇章（见表2）。

其中安进公司开发的AMG510在不到1年的时间里就获得了良好的临床结果，这也是首个公布临床试验数据的KRASG12C抑制剂，目前已经获得美国FDA批准用于治疗非小细胞肺癌以及结直肠癌。Mirati公司研发的KRASG12C抑制剂MRTX849在临床试验中也表现出良好的抗肿瘤活性。Wellspring公司研发的ARS-853表现出较好的细胞活性，但由于其药代动力学性质差，不适合进行体内研究。随后他们研发了喹唑啉类新母核抑制剂ARS-1620，其对KRASG12C显示出较好的活性以及选择性，可快速使肿瘤消退，具有极大的开发潜力。2019年5月，Wellspring公司宣布美国FDA批准了ARS-3248的临床新药研究的申请，强生公司将对其进行Ⅰ期临床试验。而勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）的相关研究表明，BI-2852能以纳摩尔级别与KRAS蛋白结合，且对携带KRAS突变的肿瘤细胞均有抗增殖作用。除以上KRASG12C小分子抑制剂外，还有多个制药企业（如辉瑞制药有限公司以及药明康德新药开发有限公司）未公开专利保护的化合物。KRAS这一曾经被认为“不可成药”的靶点，迎来了新药开发的热潮。

3KRASG12C小分子抑制剂

3.1变构位点抑制剂

KRAS变构位点抑制剂主要是通过改变KRAS蛋白结构或干扰其与核苷酸交换因子（如SOS蛋白）形成的蛋白-蛋白相互作用而发挥作用。当前研究最多的是KRASG12C变构位点抑制剂，这些变构配体与KRASG12C的结合不会干扰鸟苷核苷酸底物位点，克服了KRASG12C与GTP结合力极强的缺点。本文将变构抑制剂按结构类型分为5类：氨基乙酮类、喹唑啉类、四氢吡啶并嘧啶类、吡啶并嘧啶酮类以及吲哚类。

3.1.1氨基乙酮类Ostrem等首次报道了KRASG12C特异性抑制剂，他们先通过二硫键碎片筛选得到了片段1，进一步结构优化得到了化合物2。化合物2和KRASG12C的共晶结构显示（图4所示），化合物2共价结合到Cys12巯基上，并延伸到临近SwitchⅡ（S-ⅡP）形成的空腔，但S-ⅡP空腔并未被充分占据，更有效的共价结合基团可能有助于提高抑制剂活性。因此，研究人员设计丙烯酰胺和乙烯基磺胺等亲电基团代替二硫基团，获得了化合物3和4。在10μmol·L-1浓度下孵育24h，它们对KRASG12C的抑制率可分别达87%和100%。二者不仅能够有效占据S-ⅡP，而且使KRAS更倾向于与GDP结合，从而使KRAS更多地处于非活性状态。此外，化合物3和4对癌细胞也具有一定的抗增殖作用。该研究首次通过化合物与KRASG12C蛋白共晶体证明了占据S-ⅡP结合位点在KRASG12C驱动的癌症中的应用，为KRASG12C特异性共价抑制剂的研究和开发提供理论指导。

由于化合物4的细胞活性不佳，Patricelli等在此基础上开发了对非小细胞肺癌细胞株（H358）活性更优异的KRASG12C抑制剂。经延长化合物4的烯丙基酰胺得到了化合物5（ARS-107），其对KRASG12C突变的肺癌细胞有微弱的活性（IC50=63μmol·L-1），显示出一定的抗肺癌细胞增殖潜力。此外，由于化合物5的苯环上5位氯对活性影响较大，对苯环进行结构优化获得了化合物6（ARS-853），其活性得到了显著提高（IC50=1.6μmol·L-1）。进一步分析化合物6与KRAS的共晶结构发现（如图5所示），化合物6的丙烯基酰胺能与12位半胱氨酸形成共价键，且延伸到SwitchⅡ区域；芳香环占据疏水性区域，环丙基与周围的氨基酸形成了较强的范德华力作用。细胞活性数据表明，化合物6能够诱导细胞凋亡，延缓细胞生长，且对多种癌细胞具有抑制活性。此外，化合物6选择性地与非活性状态的GDP-KRAS结合，使KRAS锁定在失活状态。

3.1.2喹唑啉类ARS-853（化合物6）虽表现出较好的细胞活性，但其药代动力学性质较差，不适于进行体内的药效评估。此外ARS-853系列化合物结构修饰较为有限，限制了其进一步的药效改善。该系列母核的邻氨基酚和连接子区域是代谢位点，也是血浆稳定性和药代动力学较差的主要原因。因此，Janes等将重点转移到设计结构独特的母核上，头部丙烯酰胺直接连接氮甲基哌嗪，缩短连接子的距离，同时用喹唑啉取代邻氨基苯酚，使其恰好占据疏水区域，开发了喹唑啉母核类化合物，克服了ARS-853的缺点，具有更好的成药性特征。Wijeratne等首先从该专利中检索到化合物8，细胞测试结果表明，化合物8对多种肿瘤细胞均展现出较好的抑制效果。

Janes等对化合物8的对应异构体9（ARS-1620）进行了更加深入的研究。从化合物9与KRAS的共晶结构发现（如图6所示），化合物9的优势构象更加刚性，与H95形成了额外的关键作用力。化合物9与KRASG12C的结合速率（1100±200mol·L-1·s-1）比化合物8快了近1000倍（1.2±0.6mol·L-1·s-1）。此外，化合物9的细胞活性（IC50=0.150μmol·L-1）也得到了很大的提高。进一步的体内研究揭示了其口服生物利用度高（F>60%）、药理特性以及血液稳定性均较好。同时，该化合物对KRASG12C具有高效性和选择性，可快速、持续地作用于体内靶点以诱导肿瘤消退。该研究提供了体内证据，揭示以ARS-1620为代表的新一代KRASG12C抑制剂的巨大治疗潜力。

Zeng等基于S-ⅡP结合位点对专利化合物10进行了进一步的结构优化，得到了另一种喹唑啉类化合物。通过在喹唑啉2位引入氨基酰胺得到化合物11（1_AM）和12（2_AM）。与化合物10相比，化合物11可使GTP与KRAS的结合能力降低约80%，并能有效地抑制下游ERK的磷酸化。除此之外，氨基酰胺的引入还增强了对KRASG12C的选择性。在化合物11的基础上，将苯环换成萘环，同时保留氨基酰胺，得到了化合物13（3_AM）和14（4_AM），均具有较好的细胞活性（IC50分别为1.7和0.73μmol·L-1）。

3.1.3四氢吡啶并嘧啶类Fell等基于结构筛选得到了四氢吡啶并嘧啶类化合物15，在5μmol·L-1下化合物15对KRASG12C的抑制率仅为13%。进一步优化得到了化合物16，其在5μmol·L-1下的抑制率提高至99%，细胞活性为IC50=7.6μmol·L-1。鉴于嘧啶环2位对活性影响较大，在2位进行取代得到化合物17和18，化合物17与KRAS的共晶结构如图7所示。与化合物16相比合物17和18细胞活性得到了明显提升，IC50分别为540和70nmol·L-1。同时，二者能够抑制KRAS下游效应因子（如ERK）的磷酸化。化合物18的体内药效表明，腹腔给药5d可使肿瘤迅速消退，25d后肿瘤完全消除。此外，基于LC-MS（液相色谱-质谱）的检测显示，给药后，肿瘤组织中化合物18与KRASG12C的结合率可持续大于65%。最重要的是，小鼠对化合物18具有较好的耐受性，未出现体质量减轻或其他不良症状等副作用。因此，以化合物18为代表的四氢吡啶嘧啶类KRASG12C共价变构抑制剂具有良好的临床应用前景。

近期，Mirati公司的四氢吡啶并嘧啶类KRASG12C抑制剂MRTX849（结构尚未公开）在临床试验中也表现出良好的疗效。MRTX849最初是由Mirati与Array生物医药公司联合发现的，具有优异的细胞活性，IC50高达1~20nmol·L-1。与报道的其他KRAS抑制剂相比，MRTX849具有抗肿瘤活性好、口服利用度高、半衰期长等良好的成药特性。

3.1.4吡啶并嘧啶酮类2018年Lanman等报道了吡啶并嘧啶酮类专利化合物（如化合物19），其对具有KRAS突变的前列腺癌细胞显示了优异的抑制活性（IC50=0.211μmol·L-1）。对其连接子区域以及疏水区结构优化得到了化合物20和21，二者细胞活性均有了显著的提高（IC50值分别为0.054和0.012μmol·L-1）。安进公司基于此专利化合物合成了化合物22（AMG510），晶体结构表明，化合物22能很好地占据连接子区域，在疏水性区域能与周围氨基酸形成关键作用力。目前已经公布了AMG510的临床Ⅰ期试验结果，在入选的34名患者中，大多表现出良好的缓解率，且较少出现副作用。基于以上良好的临床结果，安进公司将会继续推进AMG510单一疗法和组合疗法的发展计划。

3.1.5吲哚类基于ARS-1620较好的体内疗效，Shin等基于化学型进化技术筛选得到了化合物23，其对KRASG12C的结合速率（表观速率常数kobs/[I]）为2mol·L-1·s-1。从化合物23与KRASG12C的共晶发现，SwitchⅡ处于闭合的状态，H95、Y96和Q99形成了一个新的空腔，但23并未占据此位点。进一步结构优化得到了苯环母核24和吲哚母核25两类，其结合速率分别为26mol·L-1·s-1和230mol·L-1·s-1，吲哚母核类25较化合物23活性有了100倍的提高。同时，二者对胰腺癌细胞表现了一定的活性（IC50分别为11.3和11.4μmol·L-1）。随后对吲哚母核类优化得到了26，其结合速率高达2640mol·L-1·s-1，细胞活性也有了极大的提高（IC50=0.219μmol·L-1）。共晶结果显示，四氢喹啉能很好的占据H95、Y96和Q99形成的空腔，因此活性有了较大的提高。

3.2催化位点抑制剂

催化位点抑制剂直接作用于鸟苷核苷酸底物位点，这些抑制剂通过与核苷酸竞争活性位点，破坏GTP/GDP与KRAS的结合，从而使其处于非活性状态。长期以来，直接针对RAS活性位点的小分子抑制剂的开发一直受到KRAS与底物亲和力强，以及细胞中核苷酸浓度极高的阻碍。但是近期报道的成功的共价激酶抑制剂，为解决KRAS竞争核苷酸位点的问题提供一种新的思路。

Lim等模拟GDP设计了第一个底物-竞争共价抑制剂化合物27。在1mmol·L-1GDP或GTP条件下孵育2h，化合物27与KRASG12C结合率>95%。氢交换质谱显示，化合物27改变了核苷酸结合口袋的构象，诱导其处于类似于与GDP结合的非活性形式，从而影响RAS和RAF之间的蛋白-蛋白相互作用。

由于化合物27是一种二磷酸盐化合物，其磷酸酐键易于水解，因此化学性质不稳定，膜穿透能力差。为了解决此问题合成了化合物28，化合物28的细胞通透性增强，具有一定的抗癌细胞增殖活性，同时KRAS依赖的AKT和ERK通路也被抑制。Xiong等对化合物27进行生物电子等排得到了化合物29，化合物29的化学稳定性有了很大的提高。尽管与化合物27相比其对KRAS的活性有所降低，但化合物29仍然是一个非常有前景的前药化合物。

4组合疗法

近期的临床结果显示，有些非小细胞肺癌患者已经出现了单药疗法的耐药性，而AMG510对结直肠癌患者的部分缓解率只有不到10%。因此各大公司逐渐转向组合疗法，主要有：与程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）免疫抑制剂联用、与相关信号通路靶点抑制剂联用以及与化疗药物联用。

4.1与PD-1抑制剂联用

研究表明，携带KRASG12C的非小细胞肺癌患者的PD-1表达水平较高，表明他们适合接受提高T细胞抗肿瘤活性的抗PD-1抑制剂的治疗。Baraibar等研究了在KRAS突变的肺癌患者中，阻断PD-1通路，增强CD8/CD3阳性T细胞肿瘤浸润，显示了肿瘤治疗的优异效果。

Mirati公司指出MRTX849与PD-1抑制剂联用可能具有协同效应。安进公司的小鼠实验结果也表明，单独使用AMG510时，在10只携带KRASG12C突变肿瘤的小鼠中，仅一只小鼠的肿瘤完全消退，单独使用PD-1抑制剂的效果与此类似，但当联合用药时，10只小鼠中有9只携带的肿瘤长时间完全消退，且未出现复发。验证了KRASG12C抑制剂与PD-1抑制剂联用时，能够增强抗癌效果。

4.2与相关信号通路靶点抑制剂联用

同时抑制同一信号通路的不同靶点，或者不同的信号通路均可增强抗癌疗效。基于这一策略，Christensen等研究了MRATX1257与相关信号通路靶点抑制剂联用机制，为联合用药提供了思路。勃林格殷格翰公司近期将BI-2852与分裂原活化抑制剂（MEK抑制剂）联用，用于治疗胃肠道和肺癌。安进公司为了验证AMG510是否也能与其他靶点产生协同效应，将AMG510联合其他靶点抑制剂进行了相关实验。结果表明，AMG510与人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（HER激酶抑制剂）、含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂（SHP2抑制剂）以及MEK抑制剂均具有较强的协同作用。Misale等将KRAS抑制剂与PI3K抑制剂联用也产生了较好的协同效果。Lu等也研究了SHP2抑制剂以及MEK抑制剂对KRAS突变肿瘤的作用。这些数据表明，与同一信号通路的不同靶点的抑制剂联用，可以从源头制约这一信号通路，同时可能消除旁路或者残余信号传导，有助于提高抗肿瘤效果以及防止耐药性的产生。

4.3与化疗药物联用

安进公司的研究人员首次尝试了将AMG510与化疗药物卡铂联用。对荷有肿瘤的模型动物的研究表明，单独使用AMG510和卡铂时，均能显著缩小肿瘤的体积，但是当两者联用时，肿瘤体积能更快更明显地缩小，显著增强了抗肿瘤效果。这一结果为在临床试验中使用这一组合疗法提供了理论基础。

延伸阅读：PD-1/PD-L1：跨国药企与本土药企的较量

目前PD-1/ PD-L1类药物已成为全球抗肿瘤单抗主流力量，自2014年获批上市以来市场异常火爆。全球已上市的企业有默沙东、百时美施贵宝、罗氏、辉瑞、阿斯利康、再生元赛诺菲等，国内进口企业已上市的有百时美施贵宝、默沙东、罗氏、阿斯利康；国内本土企业已上...全文>>

5总结与展望

KRAS作为癌症中最常突变的致癌基因，由于其蛋白表面没有适合小分子抑制剂结合的口袋，导致直接靶向KRAS的小分子药物开发在过去30多年里没有重大突破。近年来的研究发现，在KRASG12C突变体中，存在着一个能够被共价抑制剂结合的变构位点。小分子抑制剂通过与突变生成的半胱氨酸共价结合，将KRASG12C的构象锁定在失活状态，从而抑制KRASG12C突变体的活性。该发现使KRASG12C这一“不可成药”靶点有了重大突破，受到了业界的广泛关注。

目前已有多个KRASG12C抑制剂处于临床阶段。但临床结果同时也表明，有些患者已经出现单药疗法的耐药性。一些制药企业开始转向组合疗法的探索，将KRASG12C抑制剂与其他抑制剂联用显示出较强的抑制肿瘤效果以及不易产生耐药性的优势，这对KRASG12C抑制剂的临床试验推进具有重要意义。

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