学科前沿|武汉大学刘天罡教授于《先进科学》发表利用无细胞体系挖掘羊毛硫肽类天然产物发现并指导体内高产的相关研究成果

7月21日，Advanced Science（《先进科学》IF=15.84）以长文Full Paper形式发表武汉大学药学院刘天罡教授团队的最新研究成果，论文题为“A Cell-Free Platform Based on Nisin Biosynthesis for Discovering Novel Lanthipeptides and Guiding Their Overproduction In Vivo”（《基于乳酸链球菌素生物合成的无细胞平台用于发现新的羊毛硫肽和指导其体内高产》）。

图1. 无细胞平台用于发现新的羊毛硫肽和指导其体内高产

武汉大学药学院博士生刘然为第一作者，武汉大学药学院刘天罡教授为该论文的独立通讯作者。该研究工作得到国家重点研发计划合成生物学专项、国家自然科学基金、湖北省杰出青年基金的大力支持。

天然产物中有一类称之为核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPPs），顾名思义该类化合物是指由核糖体合成的多肽，再经过翻译后修饰而得到的一大类天然产物，而其中又以羊毛硫肽类（Lanthipeptide）化合物最具有代表性，这类化合物具有广泛的结构和生物活性多样性，来源也非常广泛。比如，乳酸链球菌素（nisin），为什么酸菜不会腐烂？火腿肠如何能够常温放置数月？都是乳酸链球菌素超级杀菌的功劳，但是其有能够被人体分泌的酶分解成氨基酸，其被WHO和FDA批准作为安全的食物防腐剂已经使用了几十年。

根据大量的基因组信息暗示，目前已被发现并鉴定的羊毛硫肽类化合物仅仅占自然界的很小一部分，有大量未知的羊毛硫肽类化合物有待发现和阐明，但很多含有相关基因的微生物在实验室条件中无法培养或者在实验室条件下无法产生羊毛硫肽。虽然研究人员开发了大肠杆菌、乳酸菌等异源表达系统，但这种方式一方面容易形成包涵体，另一方面由于大多数羊毛硫肽具有抑菌性，因此在异源宿主微生物内表达羊毛硫肽就变成了自相矛盾，想要找到很好的矛（羊毛硫肽），但是它却刺破了盾（异源宿主微生物）。此外，由于该类化合物具有重要的工业和医用价值，提升该类化合物的产量有迫切需求，虽然对于其生物合成的酶学机理有很好的基础，但是整个体系的限速步骤还没有确定，无法精准进行改造。

基于以上科学问题，刘天罡教授团队开发了一套无细胞蛋白合成平台（cell-free protein synthesis, CFPS），以其中研究最为透彻的nisin为目标化合物。羊毛硫肽的基因簇虽然较为复杂，但是其中大部分是宿主为了抵抗自身的抑菌活性等而合成的免疫蛋白、转运蛋白以及调节蛋白，而真正负责合成羊毛硫肽的基因只有少数几个。因此，在体外无细胞系统中解决目前在羊毛硫肽研究中面临的种种问题即简单又高效，矛和盾的问题在无细胞体系中不存在了！

在这项工作中，首先搭建nisin的CFPS高效合成平台，通过在CFPS平台利用系统滴定的方式锁定其生物合成的限速步骤，并以其精准指导工业菌株代谢改造，一步改造使nisin产量提升60%；并以此原则指导异源宿主进行代谢改造，也使产量提升近90%。其次，利用该平台在一天之内将NCBI数据库中所有与nisin骨架类似的潜在羊毛硫肽中进行了挖掘，从中鉴定到4条具有抑菌活性（包括对耐药菌MRSA的抑菌活性）的新羊毛硫肽，其中1条对临床致病菌株粪肠球菌的抑菌活性优于nisin。第三，构建了nisin的突变体的文库，利用搭建的CFPS平台对其进行高通量筛选，最终从中筛选到一条有5个突变位点的羊毛硫肽M5, 将这种抗革兰氏阳性菌的化合物赋予了具有抗革兰氏阴性菌的活性。本研究成果可为高产羊毛硫肽及挖掘新的羊毛硫肽提供一种普适、快速、高效的方法，并且形成的CFPS平台也可应用于其他RiPPs的研究。

图2. 羊毛硫肽无细胞合成平台

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202001616

刘天罡课题组链接：http://liugroup.whu.edu.cn/

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